聚丙烯酰胺凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)
PolyGel Extraction Kit
目錄號(hào)：YJ0526
運(yùn)輸條件：室溫（15-25℃）。
保存條件：室溫（15-25℃）。
組分說(shuō)明
Cat. No. YJ0526
Kit Size 50
Buffer PL 100 ml
Diffusion Buffer 30 ml
Buffer PS 15 ml
Buffer PW（concentrate） 10 ml
Buffer EB 10 ml
Spin Column DM 50
Filter 50
Collection Tube（2 ml） 100
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本試劑盒采用新型硅基質(zhì)膜及特殊的緩沖液系統(tǒng)，專(zhuān)一結(jié)合 DNA，可從聚丙
烯酰胺凝膠中回收 DNA，并可zui大限度去除引物、酶、礦物油等雜質(zhì)，獲得高純
度的DNA，滿(mǎn)足多種實(shí)驗(yàn)要求。本試劑盒可回收50 bp-50 kb的DNA片段，能有效避免
大片段DNA在純化過(guò)程中被切斷，每個(gè)吸附柱可zui高吸附20 μg的DNA，且DNA回收效率高達(dá)90%。由本試劑盒回收純化的DNA可直接用于酶切，連接，PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)
序等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑：無(wú)水乙醇，離心管。
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)
1．*次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說(shuō)明在Buffer PW中加入無(wú)水乙醇。
2．使用前請(qǐng)檢查Buffer PL是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在37℃
水浴幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。
3．電泳時(shí)使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。
4．切膠時(shí)，紫外照射時(shí)間應(yīng)盡量短，以免對(duì)DNA造成損傷。
5．回收率與初始DNA量和洗脫體積有關(guān)。
6．離心步驟均為使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。
操作步驟
1．將單一的目的DNA條帶從聚丙烯酰胺凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的
離心管（自備）中，稱(chēng)取重量。
2．將凝膠充分搗碎，向凝膠中加入1-2倍體積的Diffusion Buffer（如100mg凝膠加入
100-200 μl Diffusion Buffer），75℃孵育30分鐘。
3．12,000 rpm（~13,400×g）離心1分鐘，小心吸取上清，將之加入到已裝入收集管的
Filter（過(guò)濾柱）中，12,000 rpm離心1分鐘，將離心所得的濾液收集在收集管中。
4．向?yàn)V液中加入3倍體積的Buffer PL；當(dāng)回收的目的片段<100 bp時(shí)，加入6倍體積的
Buffer PL，上下顛倒混勻。
注意：此時(shí)可以檢測(cè)其pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的膠溶液中加10-30 μl 的3 M醋酸鈉（pH 5.0）將pH值調(diào)到5-7。
5．柱平衡：向已裝入收集管（Collection Tube）中的吸附柱（Spin Column DM）中加
入200 μl Buffer PS，12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新
放回收集管中。
6．將步驟4中所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm
離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱容積為700 μl，若樣品體積大于700 μl可分批加入。
7．向吸附柱中加入650 μl Buffer PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000
rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
注意：如果純化的DNA 是用于鹽敏感的實(shí)驗(yàn)，例如平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，建議加入Buffer PW后靜置2-5分鐘再離心。
8．將吸附柱放回收集管中，12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置
于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干。
注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、
PCR等）。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。
9．將吸附柱放到一個(gè)新離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加 20 μl Buffer
EB，室溫放置2分鐘； 12,000 rpm離心2分鐘，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。
注意：1）洗脫液的pH值對(duì)于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍）。
2）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回吸附柱中，重復(fù)步驟9。
3）洗脫體積不應(yīng)小于20 μl，體積過(guò)少影響回收效率。
4）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。
5）回收大于10 kb的DNA片段時(shí)，Buffer EB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，適當(dāng)延長(zhǎng)吸附和洗脫時(shí)間，可增加回收效率。
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